Frequencydomain fluorescence spectroscopy instrumentation and applications

Abstract

Timeresolved uorescence measurements are often performed by direct measurements in the timedomain In this article we describe the alternative method of frequencydomain uorometry The frequencyresponse of the emission to intensitymodulated excitation can be used to recover the timedependent decay Commercial instrumentation now allows measurements to an upper light modulation frequency limit of 200 MHz This laboratory has developed second and third generation instruments operating with picosecond laser systems and fast detectors which allow measurements to 2 GHz and subsequently to 10 GHz The frequencydomain data from such instrumentation provides excellent resolution of picosecond decays of intensity and anisotropy Additionally the frequencydomain method appears to provide remarkable resolution of complex decays which are often observed for biochemical samples In this article we describe this instrumentation and applications of the frequencydomain method Examples are shown using probes with ps decay and correlation times the intrinsic uorescence of proteins and the measurement of diffusion dependent energy transfer We also describe the use of a pulsed frequencydoubled laser diode as a 413 nm excitation light source for frequencydomain uorescence measurements

يتم عادة تسجيل الفلورة المحللة زمنيا بقياسات مباشرة في المجال الزمني وفي هذه الورقة نصف طريقة بديلة باستخدام فلورة المجال الترددي ؛ حيث يمكن استخدام استجابة تردد الانبعاث للتضمين في شدة التهيج لقياس التضاؤل المعتمد على الزمن يمكن للأجهزة التجارية أن تقيس ذبذبة تضمين للضوء بحد أعلى إلى (200) ميجاهرتز، ولكننا في هذا المختبر طورنا الجيل الثاني والثالث من أجهزة تعمل بأنظمة ليزر البيكوثانية والكاشفات السريعة وبذلك نقيس إلى (2) جيجاهرتز وبالتالي إلى (10) جيجاهرتز إن معلومات المجال الترددي التي يتحصل عليها من هذه الأجهزة تعطي تحليلا ممتازا لتضاؤل الشدة الضوئية في البيكوثانية وفي تباين الخواص وبالإضافة إلى ذلك فإن طريقة المجال الترددي تعطي تحليلا مدهشا للتضاؤل المعقد الذي يلاحظ للمواد البيوكيماوية وفي هذا البحث نصف الجهاز وتطبيقات طريقة المجال الترددي ونعطي أمثلة على استخدام مسابر ذات تضاؤل في البيكوثانية وأوقات الترابط، والفلورة الذاتية للبتروتينات، وقياس نقل الطاقة المعتمد على الانتشار وبالإضافة إلى ذلك نصف استخدام ليزر الدايود النبضية ذات الذبذبة المضاعفة عند طول موجة تهييج (413) نانومتر لقياس فلورة المجال الترددي